vsearch2.8.1中文帮助文档(免费64位版usearch)
简介
USEARCH是最好用的扩增子分析软件，但是代码不开源，可分析大数据的64位版收费，阻止了很多经费有限小伙伴的学习和使用。
因此VSEARCH因时而生，免费、开源，让大家分析扩增子即方便，又免费，同时算法公开透明。更多介绍见下文链接：
vsearch主要功能有 - 嵌合体检测、聚类、去冗余、添加重复、fa/fq文件处理、masking、两两比对、搜索、重排、排序、抽样、物种分类(宏基因组、基因组和群体遗传)等。
此软件从14年11月28日发布v1.0.0以来，目前已经更新了89个版本，最新版于18年6月22号更新v2.8.1。主页：https://github.com/torognes/vsearch，
拥有主流操作系统Windows/Mac/Linux的各种版本，方便跨平台使用。
18年7月28日，最新版仍为 2.8.1 (180622)
以Windows版本为例，下面是下载链接
https://github.com/torognes/vsearch/releases/download/v2.8.1/vsearch-2.8.1-win-x86_64.zip
里面有程序文件，还有帮助文档。
主要功能和命令行格式
嵌合体检测
Chimera detection:
序列自身比对去嵌合
vsearch (—uchime_denovo | —uchime2_denovo | —uchime3_denovo) fastafile (—chimeras |
—nonchimeras | —uchimealns | —uchimeout) outputfile [options]
常用最新的uchime3进行denovo去嵌合，—nonchimeras指定输出过滤后的结果
基于参考数据库去嵌合
vsearch —uchime_ref fastafile (—chimeras | —nonchimeras | —uchimealns | —uchimeout) outputfile
—db fastafile [options]
再使用uchime_ref进行有参去嵌合体，数据库推荐使用又大又全的SILVA最新版本。同时推荐不要基于参考序列去嵌合，因为亲本缺少丰度信息情况下，容易造成假阴性。而de novo去嵌合时，要求亲本的丰度至少是嵌合体的16倍以上，这样可以较少控制假阴性率。
聚类
Clustering:
vsearch (—cluster_fast | —cluster_size | —cluster_smallmem | —cluster_unoise) fastafile (—alnout |
—biomout | —blast6out | —centroids | —clusters | —mothur_shared_out | —msaout | —otutabout |
—profile | —samout | —uc | —userout) outputfile —id real [options]
按丰度高到低聚类选择cluster_fast，非聚类的精度序列变异选择cluster_unoise算法。
去冗余
Dereplication and rereplication:
vsearch (—derep_fulllength | —derep_prefix) fastafile (—output | —uc) outputfile [options]
vsearch —rereplicate fastafile —output outputfile [options]
合并序列采用derep_fulllength去冗余，非冗余序列名中包括测序获得非冗余序列的次数(count值)
序列操作
FASTA/FASTQ file processing:
质量评估
vsearch —fastq_chars fastqfile [options]
格式转换
如phred64 - phred33
vsearch —fastq_convert fastqfile —fastqout outputfile [options]
质量统计
vsearch (—fastq_eestats | —fastq_eestats2) fastqfile —output outputfile [options]
质量控制
vsearch —fastq_filter fastqfile (—fastaout | —fastaout_discarded | —fastqout | —fastqout_discarded)
outputfile [options]
双端序列合并
vsearch —fastq_mergepairs fastqfile —reverse fastqfile (—fastaout | —fastqout | —fastaout_notmerged_fwd | —fastaout_notmerged_rev | —fastqout_notmerged_fwd | —fastqout_notmerged_rev |—eetabbedout) outputfile [options]
双端序列合并，左端为默认参数，—reverse为右端文件, —fastqout指定输出文件，—fastaout_notmerged_fwd, —fastaout_notmerged_rev,可输出末匹配的结果，—eetabbedout输出统计至文件，—fastq_truncqual可移除3‘端低质量区。—fastq_minlen可过滤短序列，默认1。—fastq_maxns过滤N序列，默认不限制。默认不允许Overhang，除非使用—fastq_allowmergestagger。最小重叠区—fastq_minovlen默认为10，序列过长可调小。—fastq_maxdiffs设置重叠区数，默认最大10，—fastq_maxdiffpct可设置错配比例，默认为100%。扩增子有切胶回收目的片段的产物，已知情况下可按最大、最小长度过滤，—fastq_minmergelen and —fastq_maxmergelen。其它的参数还有—fastq_ascii, —fastq_maxee, —fastq_nostagger, —fastq_qmax, —fastq_qmaxout, —fastq_qmin, —fastq_qminout, and —label_suffix
序列统计
vsearch —fastq_stats fastqfile [—log logfile] [options]
序列取反向互补
vsearch —fastx_revcomp fastxfile (—fastaout | —fastqout) outputfile [options]
屏蔽序列
Masking:
Fasta/q文件屏蔽低复杂序列
vsearch —fastx_mask fastxfile (—fastaout | —fastqout) outputfile [options]
Fasta文件屏蔽低复杂序列
vsearch —maskfasta fastafile —output outputfile [options]
两两比对
Pairwise alignment:
序列自身两两全局比对
vsearch —allpairs_global fastafile (—alnout | —blast6out | —matched | —notmatched | —samout |
—uc | —userout) outputfile (—acceptall | —id real) [options]
搜索
Searching:
搜索序列完全一致结果
vsearch —search_exact fastafile —db fastafile (—alnout | —biomout | —blast6out |
—mothur_shared_out | —otutabout | —samout | —uc | —userout) outputfile [options]
全局比对，用于生成OTU表
vsearch —usearch_global fastafile —db fastafile (—alnout | —biomout | —blast6out |
—mothur_shared_out | —otutabout | —samout | —uc | —userout) outputfile —id real [options]
重排与排序
Shuffling and sorting:
序列洗牌、按长度排序、排丰度排序
vsearch (—shuffle | —sortbylength | —sortbysize) fastafile —output outputfile [options]
抽样
Subsampling:
fastq/a文件抽样
vsearch —fastxsubsample fastafile (—fastaout | —fastqout) outputfile (—sample_pct real | —sample
size N) [options]
物种分类
Taxonomic classification:
sintax算法物种注释
vsearch —sintax fastafile —db fastafile —tabbedout outputfile [—sintax_cutoff real] [options]
处理UDB数据库索引
UDB database handling:
比对数据库建索引
可节约每次建索引时间
vsearch —makeudb_usearch fastafile —output outputfile [options]
转换索引为fasta序列文件
vsearch —udb2fasta udbfile —output outputfile [options]
索引文件统计
vsearch (—udbinfo | —udbstats) udbfile [options]
描述
vsearch主要用途是扩增子分析过程中的序列处理，包括序列质控、去冗余、聚类、去嵌合、生成OTUs表等
输入
输入文件为标准的fasta或fastq格式；
当序列名中存在整数时，会作为丰度用于输助嵌合体检测、OTU聚类/去噪代表性序列选择；
文件中字母大小写是有意义的，正常为大写，小写为软屏蔽(soft masking)
输入文件支持管道操作，用-代替管道的输入文件，实现多命令连用
支持gzip或bzip2压缩文件，在管道中来的压缩文件需要加参数--gzip_decompress
参数
通用参数
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —bzip2_decompress | 当管道流入bzip2压缩格式时使用，直接读取压缩文件时不需要 |
| —fasta_width | 输出fasta格式默认为80个nt一行，参数可设置输出fasta列宽 |
| —gzip_decompress | 当管道流入gzip压缩格式时使用，直接读取压缩文件时不需要 |
| —help或-h | 显示帮助并退出 |
| —log filename | 日志写入文件 |
| —maxseqlength N | 最大序列长度，默认长度>50000将丢弃 |
| —minseqlength N | 最小序列长度，排序和洗牌时默认为1，聚类、去冗余或搜索时为32 |
| —no_progress | 不显示运行进度 |
| —notrunclabels | 保留完整序列名，默认去掉空格或制表符后面的信息 |
| —quiet | 除警告或致命错误，其它标准输出和标准误信息不输出 |
| —threads N | 计算使用的线程数，范围1-256。要<=CPU核数，默认使用全部。支持多线程命令有allpairs_global, cluster_fast, cluster_size, cluster_smallmem, fastq_mergepairs, maskfasta, search_exact, uchime_ref, and usearch_global |
| —version或-v | 输出版本信息并退出 |
嵌合体检测参数
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —abskew real | —uchime_denovo时，丰度比例用于检测谁是嵌合，谁是亲本。—uchime3_denovo默认值为16，其它时为2，即亲本是嵌合体2倍以上，必须大于1 |
| —alignwidth N | —uchimealns时，设置三路比对的宽度，默认为80，0为无限制 |
| —borderline 文件名 | 输出无法确定的嵌合体，它们像嵌合体，但不足以区分其和亲本 |
| —chimeras 文件名 | 输出嵌合体序列 |
| —db 文件名 | 使用—uchime_ref指定数据库fasta文件 |
| —dn real | No vote pseudo-count, corresponding to the parameter n in the chimera scoring function (default value is 1.4). |
| —fasta_score | 输出结果中包含嵌合体打分 |
| —mindiffs N | 每部分最小不同，默认3。—uchime2_denovo和—uchime3_denovo中此参数无效 |
| —mindiv real | 与亲本最小分歧，默认0.8，同上 |
| —minh real | 最小得分(h)，增大此值可减少假阳性、增加敏感性。默认0.28，范围0-1，同上 |
| —nonchimeras filename | 输出无嵌合体结果文件 |
| —relabel string | 序列重命名，—sizeout保留丰度注释 |
| —relabel_keep | 重命名时保留原始名称 |
| —relabel_md5 | 按序列md5值重命名 |
| —relabel_sha1 | 按序列sha1值重命名 |
| —self | -uchime_ref时，忽略原始和数据库中的同名序列 |
| —selfid | -uchime_ref时，忽略原始和数据库中完全相同的序列 |
| —sizeout | 输出文件添加丰度值 |
| —uchime_denovo filename | 序列按丰度排列，自身去嵌合，无需参考数据库，不支持多线程 |
| —uchime2_denovo filename | UCHIME2算法去嵌合，按丰度排序，类似扩增子去噪—cluster_unoise |
| —uchime3_denovo | 与uchime2类似，—abskew默认是16，而不是2 |
| —uchime_ref | 有参去嵌合 |
| —uchimealns | 输出嵌合体三路比较结果 |
| —uchimeout | 嵌合体比对详细 |
| —uchimeout5 | usearch5版本格式 |
| —xn real | No vote weight, corresponding to the parameter beta in the scoring function (default value is 8.0). |
| —xsize | 去除丰度值 |
聚类参数
vsearch采用单路、贪婪中心聚类算法。
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —biomout filename | 输出biom格式1.0的OTU表，JSON文件，详见http://biom-format.org/documentation/format_versions/biom-1.0.html |
| —centroids filename | 输出中心序列作为代表序列 |
| —clusterout_id | 当使用—consout和—profile时，添加簇的标志符信息 |
| —clusterout_sort | —consout, —msaout和—profile时，结果按丰度降序排列 |
| —cluster_fast | 按序列长度排序聚类 |
| —cluster_size | 按序列丰度排序聚类 |
| —cluster_smallmem | 省内存方式聚类，不按丰度排序，默认按长度，除排指定—usersort |
| —cluster_unoise | 采用unoise3算法去噪。—minsize默认值为8，—unoise_alpha默认值为2，完成后需要连用—uchime3_denovo |
| —clusters string | 输出结果为每条序列一个fasta文件 |
| —consout filename | 输出每个cluster比对的一致序列 |
| —cons_truncate | This command is ignored. A warning is issued. |
| —id real | 相似度阈值 |
| —iddef 01234 | 修改id的定义，0. CD-HIT definition: (matching columns) / (shortest sequence length).n1. edit distance: (matching columns) / (alignment length). 2. edit distance excluding terminal gaps (same as —id). 3. Marine Biological Lab definition counting each gap opening (internal or terminal) as a single mismatch, whether or not the gap was extended: 1.0 - [(mismatches + gap openings)/(longest sequence length)] 4. BLAST definition, equivalent to —iddef 1 in a context of global pairwise alignment. |
| —minsize N | —cluster_unoise最低丰度，默认8 |
| —msaout filename | 输出多序列比对 |
| —mothur_shared_out filename | mother格式OTU表 |
| —otutabout filename | 经典表格格式 OTU表 |
| —profile filename | 多序列比对频率谱文件 |
| —qmask none dust soft | 屏蔽序列的方法 |
| —relabel string | 序列重命名，—sizeout保留丰度注释 |
| —relabel_keep | 重命名时保留原始名称 |
| —relabel_md5 | 按序列md5值重命名 |
| —relabel_sha1 | 按序列sha1值重命名 |
| —sizein | 考虑序列的丰度注释，search for the pattern ’[>;]size=integer[;]’ in sequence headers |
| —sizeorder | 扩增子有多个可能中心时，考虑丰度优先 |
| —sizeout | 输出结果带丰度信息 |
| —strand plus或both | 默认只检测正链 |
| —uc filename | uclust结果格式 |
| —unoise_alpha real | 默认为2，—cluster_unoise命令的子参数 |
| —usersort | -cluster_smallmem下可指定序列顺序 |
| —xsize | 去除丰度信息 |
| 其它参数 | Most searching options as well as score filtering, gap penalties and masking also apply to clustering (see the Searching section for definitions): —alnout, —blast6out, —fastapairs, —matched, —notmatched, —maxaccept, —maxreject, —samout, —userout, —userfields |
序列去冗余
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —derep_fulllength | 序列去冗余 |
| —derep_prefix | 序列重命名 |
| —maxuniquesize N | 过滤高丰度reads |
| —minuniquesize N | 过滤低丰度reads，常用8，RPM1等 |
| —output filename | 输出结果 |
| —relabel string | 序列重命名，—sizeout保留丰度注释 |
| —relabel_keep | 重命名时保留原始名称 |
| —relabel_md5 | 按序列md5值重命名 |
| —relabel_sha1 | 按序列sha1值重命名 |
| —sizein | 考虑序列的丰度注释，search for the pattern ’[>;]size=integer[;]’ in sequence headers |
| —sizeout | 输出结果带丰度信息 |
| —strand plus或both | 默认只检测正链 |
| —topn N | 输出丰度前N个 |
| —uc filename | uclust结果格式 |
| —xsize | 去除丰度信息 |
| —eeout | —fastq_filter or —fastq_mergepairs, include the number of expected errors (ee) in the sequence header of FASTQ and FASTA files. This option is a synonym of the —fastq_eeout option. |
| —eetabbedout filename | —fastq_mergepairs命令输出统计结果 |
| —fastaout filename | 输出结果 |
| —fastaout_notmerged_fwd filename | 无法合并正向序列 |
| —fastaout_notmerged_rev filename | 无法合并反向序列 |
| —fastaout_discarded filename | 过滤抛弃的数据 |
| —fastq_allowmergestagger | 允许合并交错的序列(存在overhang) |
| —fastq_ascii N | 质量值类型，默认33，可选 64 |
| —fastq_asciiout N | 输出质量值类型 |
| —fastq_chars filename | 统计序列质量组成 |
| —fastq_convert filename | 33、64格式转换 |
| —fastq_eeout | 文件序列名中有期望错误率 |
| —fastq_eestats | 错误率统计报表 |
| —fastq_eestats2 | 错误率统计报表2 |
| —fastq_filter | 按质量或长度过滤fasta |
| —fastq_maxdiffs N | —fastq_mergepairs双端互补合并时最大错误率，默认为10，末端低质量且重叠区大时可增大此值 |
| —fastq_maxdiffpct real | 设置匹配比例，默认为100% |
| —fastq_maxee real | 最大错误率碱基个数阈值，—fastq_filter, —fastq_mergepairs or —fastx_filter,配合使用 |
| —fastq_maxee_rate real | 最大错误率碱基比例阈值，—fastq_filter, —fastq_mergepairs or —fastx_filter,配合使用 |
| —fastq_maxlen N | 最大长度 |
| —fastq_maxmergelen N | 合并后最大长度，默认无限制，可用于去除非目标片段序列 |
| —fastq_maxns N | 去除有N的序列 |
| —fastq_mergepairs filename | 双端序列合并，左端为默认参数，—reverse为右端文件, —fastqout指定输出文件 |
| —fastq_minlen N | 最小长度 |
| —fastq_minmergelen N | 合并后最小长度 |
| —fastq_minovlen N | 合并时最小重叠区 |
| —fastq_nostagger | 禁止合并末端不匹配overhang |
| —fastq_qmax N | 最大质量值，默认为41 |
| —fastq_qmaxout N | —fastq_convert转换时输出质量的最大值 |
| —fastq_qmin N | 最小质量值，默认为0 |
| —fastq_qminout N | 输出文件的最小质量值 |
| —fastq_stats filename | 序列长度、数量、质量统计 |
| —fastq_stripleft N | 左端切除碱基数，如barcode、正向引物 |
| —fastq_stripright N | 右端切除碱基数，如反向引物 |
| —fastq_tail N | 统计末尾4kmer频率，可修改长度 |
| —fastq_truncee real | 错误率过滤 |
| —fastq_trunclen N | 长度过滤 |
| —fastq_trunclen_keep N | 按长度过滤，但保留存序列 |
| —fastq_truncqual | 按质量值过滤 |
| —fastx_revcomp | 取反向互补 |
| —label_suffix string | —fastx_revcomp or —fastq_mergepairs结果重命名 |
| —maxsize N | 最高丰度阈值 |
| —minsize N | 最小丰度阈值 |
| —output filename | —fastq_eestats或—fastq_eestats2的质量统计结果 |
| —relabel_keep | 重命名时保留原始名称 |
| —relabel_md5 | 按序列md5值重命名 |
| —relabel_sha1 | 按序列sha1值重命名 |
| —reverse filename | 合并时指定右端 |
| —xsize | 移除丰度信息 |
屏蔽序列选项
Masking options:
扩增子中使用不多，此处P18-P19略，详见帮助
成对比对选项
Pairwise alignment options:
扩增子中使用不多，此处P19-P20略，详见帮助
搜索选项
Searching options: P20-27
搜索参数过多，有上百个，此处只列出常用的参数
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —alnout filename | 输出全局成对比较结果 |
| —biomout filename | biom1.0格式OTU表 |
| —blast6out filename | blast表格格式比对结果 |
| —db filename | 指定数据库或参考文件 |
| —gapext string | 设置gap扩展罚分 |
| —gapopen string | 设置gap打开罚分 |
| —id real | 相似度，常用0.97，0.99 |
| —samout filename | 比对结果为sam格式 |
| —search_exact filename | 完美匹配结果 |
| —usearch_global filename | 比对参考数据库、OTU |
洗牌参数
Shuffling options:
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —randseed N | 随机数种子，保证结果可重复 |
| —shuffle filename | 随机洗牌序列顺序 |
排序参数
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —maxsize N | 按—sortbysize排序时，丰度最大值 |
| —minsize N | 按—sortbysize排序时，丰度最小值 |
| —output filename | 输出文件 |
| —sizeout | 输出丰度 |
| —sortbylength filename | 按长度排序 |
| —sortbysize filename | 按丰度排序 |
| —topn N | 选择最长、最高丰度的 |
抽样参数 P29
Subsampling options:
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —fastaout filename | 输出fasta文件 |
| —fastaout_discarded filename | 剩余序列 |
| —fastqout filename | fq类型结果 |
| —fastqout_discarded filename | 剩余序列 |
| —fastx_subsample filename | 抽样fa/fq |
| —randseed N | 随机数种子 |
| —sample_pct real | 抽样比例0-100 |
| —sample_size N | 提取指定数量的序列 |
物种分类
Taxonomic classification options:P30
数据库为fasta文件，序列名格式 “>X80725_S000004313;tax=d:Bacteria,p:Proteobacteria,c:Gammaproteobacteria, o:Enterobacteriales,f:Enterobacteriaceae,g:Escherichia/Shigella,s:Escherichia_coli”.
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —db filename | 数据库 |
| —sintax_cutoff real | 最小的bootstrap支持率 |
| —sintax filename | 输入文件 |
| —tabbedout filename | 输出文件，4列表 |
索引格式UDB P31
UDB options:
| 参数 | 描述 |
|---|---|
| —dbmask none dust soft | 屏蔽序列方法，默认为none |
| —makeudb_usearch filename | 创建索引 |
| —output filename | 输出结果 |
| —udb2fasta filename | 数据库索引转fasta |
| —udbinfo filename | 检查索引信息 |
| —udbstats filename | 索引统计 |
| —wordlength N | 索引的词宽，3-15，默认8 |
刻意改变
DELIBERATE CHANGES —— P34
—cluster_size 命令将序列先排序，再聚类
—iddef 保留了可变成对比对一致比例的可调选项
—sizein 读取丰度 在去冗余和聚类中都可用，方便多批数据混合使用
对待U/T无区别
使用示例
数据库中序列两两比对
Align all sequences in a database with each other and output all pairwise alignments:
vsearch —allpairs_global database.fas —alnout results.aln —acceptall
De novo检测嵌合体，父母本的丰度至少为嵌合体的1.5倍
Check for the presence of chimeras (de novo); parents should be at least 1.5 times more abundant than
chimeras. Output non-chimeric sequences in fasta format (no wrapping):
vsearch —uchime_denovo queries.fas —abskew 1.5 —nonchimeras results.fas —fasta_width 0
97%聚类，并选择中心为代表序列，输出uclust格式
Cluster with a 97% similarity threshold, collect cluster centroids, and write cluster descriptions using a uclust-like format:
vsearch —cluster_fast queries.fas —id 0.97 —centroids centroids.fas —uc clusters.uc
序列去冗余，同时考虑序列名中的丰度信息，选择丰度大于1的序列
Dereplicate the sequences contained in queries.fas, take into account the abundance information already
present, write unwrapped fasta sequences to queries_unique.fas with the new abundance information, discard all sequences with an abundance of 1:
vsearch —derep_fulllength queries.fas —sizein —fasta_width 0 —sizeout —output
queries_unique.fas —minuniquesize 2
屏蔽序列中低复杂区域
Mask simple repeats and low complexity regions in the input fasta file with the DUST algorithm (masked
regions are lowercased), and write the results to the output file:
vsearch —maskfasta queries.fas —qmask dust —output queries_masked.fas
序列比对数据库，按80%相似度，考虑末端gap
Search queries in a reference database, with a 80%-similarity threshold, take terminal gaps into account when calculating pairwise similarities, output pairwise alignments:
vsearch —usearch_global queries.fas —db references.fas —id 0.8 —iddef 1 —alnout results.aln
自己比对自己，按60%相似度，输出blast6x结果
Search a sequence dataset against itself (ignore self hits), get all matches with at least 60% similarity, and collect results in a blast-like tab-separated format. Accept an unlimited number of hits (—maxaccepts 0), and compare each query to all other sequences, including unlikely candidates (—maxrejects 0):
vsearch —usearch_global queries.fas —db queries.fas —self —id 0.6 —blast6out results.blast6
—maxaccepts 0 —maxrejects 0
重排fasta文件
Shuffle the input fasta file (change the order of sequences) in a repeatable fashion (fixed seed), and write unwrapped fasta sequences to the output file:
vsearch —shuffle queries.fas —output queries_shuffled.fas —randseed 13 —fasta_width 0
按丰度排序
Sort by decreasing abundance the sequences contained in queries.fas (using the ’size=integer’ information),
relabel the sequences while preserving the abundance information (with —sizeout), keep only sequences
with an abundance equal to or greater than 2:
vsearch —sortbysize queries.fas —output queriessorted.fas —relabel sampleA —sizeout —minsize 2
引文
Rognes T, Flouri T, Nichols B, Quince C, Mahé F. (2016) VSEARCH: a versatile open source tool for
metagenomics. PeerJ 4:e2584 doi: 10.7717/peerj.2584 https://doi.org/10.7717/peerj.2584
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写在后面
为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外1800+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍末解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。
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